Acta chirurgiae orthopaedicae et traumatologiae Cechoslovaca

Acta chirurgiae orthopaedicae et traumatologiae Cechoslovaca

Původní práce / Original papers

ACTA CHIRURGIAE ORTHOPAEDICAE ET TRAUMATOLOGIAE ČECHOSL.,
82, 2015, p. 229 - 234

Použití kultivovaných lidských autologních kmenových buněk kostní dřeně při rekonstrukci ruptury rotátorové manžety - studie bezpečnosti metody, předběžné výsledky

Use of Cultured Human Autologous Bone Marrow Stem Cells in Repair of a Rotator Cuff Tear: Preliminary Results of a Safety Study

V. HAVLAS1, J. KOTAŠKA1, P. KONÍČEK1, T.TRČ1, Š. KONRÁDOVA2,3, Z. KOČÍ2,4, E. SYKOVÁ2,4
1 Klinika dětské a dospělé ortopedie a traumatologie 2. LF UK a FN v Motole, Praha
2 Oddělelní neurověd, Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i, Praha
3 Ústav hematologie a krevní transfuze Praha
4 Ústav neurověd, 2. lékařská fakulta Univerzity Karlovy, Praha

ABSTRAKT

PURPOSE OF THE STUDY

Rotator cuff tears are one of the most frequent shoulder disorders which are often associated with pain and interfere with proper arm function. In order to evaluate the safety and effectiveness of using cultured human autologous mesenchymal stem cells (MSC) applied to the suture site during arthroscopic repair of a rotator cuff tear, a prospective clinical study was designed and started recently at the authors' department. Its primary goal was to evaluate the safety of using cultured human MSCs, the secondary goal then was to study a therapeutic effect of their application. Preliminary results of the study on a limited number of patients are presented here.

MATERIAL AND METHODS

Ten patients who met the indication criteria for arthroscopic repair of a  rotator cuff tear were included in the study. In addition, they also had to meet inclusion and lack exclusion criteria. According to the protocol, their bone marrow was harvested at 3 to 4 weeks before surgery. Subsequently, an arthroscopic repair of the rotator cuff tear was performed and an suspension of cultured MSCs was applied to the suture site at the end of the procedure. The isolation of MSCs from bone marrow and their cultivation was carried out by the company Bioinova, Ltd. The patients were followed up at 6 weeks and 3 and 6 months post-operatively. Their clinical assessment included physical examination of the shoulder, pain intensity evaluation according to the visual analogue scale (VAS), and subjective questionnaires for Constant and University of California (UCLA) scores. All patients underwent MRI examination at 6 post-operative months to evaluate the quality of rotator cuff reconstruction. The findings were compared with the pre-operative results.

RESULTS

A final evaluation was made in eight patients of 10. Two patients were excluded from the study because their exclusion criteria were fulfilled. The evaluated patients showed significantly better clinical outcomes as early as 6 weeks after surgery; also all pre-operative scores were improved at 3 and 6 months. The average values at 6 months post-operatively were: 0 points for the VAS score, 32 for the UCLA score and 84 for the Constant score. The MRI findings at 6 months after surgery showed fully healed and well-integrated tissue of the rotator cuff tendon attachment in all eight patients. No adverse effects of therapy were recorded during the follow-up period.

DISCUSSION

The use of autologous stem cells and growth factors in the treatment of tendons, muscles and cartilage is currently the topic of many experimental studies on animal models. Its utilisation in human clinical trials has been reported only marginally; the relevant studies have so far used only suspensions of non-cultured mononuclear cells. Our study, although on a  small-size patient group, provides evidence that human cultured autologous MSCs can safely be used for tissue repair in the indications mentioned above.

CONCLUSIONS

Our preliminary short-term results show that using human cultured autologous MSCs in the treatment of rotator cuff tears is safe. However, further research is needed, particularly with regard to the effectiveness of the method.

Key words: rotator cuff tear, arthroscopic repair, mesenchymal stem cells, tendon, cell therapy

Tento projekt byl podpořen GAČR P304/10/0326 a grantem projektu koncepčního rozvoje výzkumné organizace č. 00064203.

ÚVOD

Poškození rotátorové manžety je jedním z nejčastějších onemocnění ramenního kloubu a často ústí v klinicky významnou bolest a dysfunkci (10, 11, 12, 18, 22). Úspěšná léčba ruptury rotátorové manžety je často komplikovaná sníženou tendencí k hojení, a to i v případě chirurgického ošetření šlachy. Obtížné hojení šlachy je spojováno se zhoršeným cévním zásobením rotátorové manžety, souvisejícím s nedostatečnou migrací buněk účastnících se na hojících procesech ruptury šlachy (2, 5).

Histologické studie ukazují, že šlacha rotátoru se nehojí regenerací původního fibrokartilaginózního úporní šlachy, ale formací jizevnaté tkáně s vysokým obsahem kolagenu III, ke spontánnímu zhojení šlachy často nedojde vůbec (6, 21).

Recentní studie provedené na laboratorních potkanech poukazují na využití mezenchymálních kmenových buněk z kostní dřeně (mesenchymal stem cells, MSC) jako slibného terapeutického nástroje zlepšujícího hojení rotátorové manžety (8, 10, 19, 24). Byl prokázán pozitivní vztah mezi lokální aplikací MSC a  neovaskularizací na principu imunomodulace procesu hojení šlachy (3, 13, 14). Kida akol. prokázali také jasný pozitivní efekt MSC na hojení šlachy rotátoru po návrtech kosti v místě úponu šlachy (16).

Vlastností MSC je v současné době s velmi dobrými výsledky rutinně využíváno při léčbě šlachových poranění dostihových koní (7, 20). Pacini a kol. prokázali, že aplikace MSC do oblasti poškozené šlachy závodního koně jasně zlepšuje parametry hojení, což bylo prokázáno jak ultrasonograficky, tak srovnáním času návratu koně do plné závodní zátěže (20). Jiná studie prokázala na post-mortem histologických nálezech, že MSC aplikované injekčně do oblasti šlachové leze nezpůsobila ani v jednom případě imunologicky podmíněnou negativní buněčnou reakci či alteraci šlachy a jejího okolí (7).

Za účelem zhodnotit bezpečnost a efektivitu použití lidských kultivovaných autologních MSC aplikovaných do místa sutury během artroskopické rekonstrukce ruptury šlachy rotátorové manžety byla vytvořena prospektivní klinické studie, která byla recentně spuštěna na pracovišti autorů a jejímž zadavatelem je Bioinova s. r. o.

Primárním cílem klinické studie je bezpečnost použití, sekundárním cílem pak terapeutický efekt použití lidských kultivovaných MSC. Autoři prezentují předběžné výsledky studie na limitovaném počtu pacientů.

ACHOT 3/2015

MATERIÁL A METODIKA

Charakteristika souboru pacientů
ACHOT 3/2015

10 pacientů bylo na základě indikačních kritérií pro artroskopickou opravu ruptury rotátorové manžety zařazeno do studie AMCS RC 001, Eudra CT no. 2010-024664-17, registrované Státním ústavem pro kontrolu léčiv (SÚKL) dne 22. října 2012. Všichni pacienti byli seznámeni s cílem studie a poskytli informovaný souhlas verifikovaný místní etickou komisí a SÚKL. Součástí výběru pacientů bylo splnění vstupních/výstupních kritérií pro zařazení do studie tak, jak jsou popsána v tabulce 1. Po prvotním zhodnocení anamnézy, klinického vyšetření a MRI ramenního kloubu (obr. 1) byla potvrzena indikace k operačnímu řešení ruptury rotátorové manžety.

Pacienti zařazení do studie byli sledováni v intervalech 6 týdnů, 3 a 6 měsíců od operace. Klinické zhodnocení zahrnovalo klinické vyšetření ramenního kloubu, zjištění intenzity bolesti dle VAS, vyplnění subjektivních dotazníků Constant score a University of California score evaluation (UCLA), (tab. 2). Všichni pacienti podstoupili MRI kontrolu v odstupu 6 měsíců ke zhodnocení kvality rekonstrukce rotátorové manžety. Výsledky byly korelovány s předoperačním nálezem. Klinické předoperační nálezy u pacientů zařazených do souboru jsou shrnuty v tabulce 3. Eventuální nežádoucí účinky byly sledovány v souladu s  protokolem studie.

Odběr a aplikace kmenových buněk
ACHOT 3/2015

Po poskytnutí informovaného souhlasu podstoupili všichni pacienti zařazení do studie virologické a bakteriologické testy v souladu s protokolem klinické studie. Následně, 3-4 týdny před operačním výkonem, byl proveden odběr kostní dřeně. Celkem 12 ml kostní dřeně pacienta bylo získáno aspirací z crista ilaca v sedaci a lokální anestezii. Punkce byla prováděna aspirační jehlou v poloze nazádech. K odběru byla použita speciální 20 ml injekční stříkačka obsahující fyziologický roztok s heparinem o koncentraci 750 IU/ml a gentamycin o  koncentraci 68 ?g/ml (Bioinova s. r. o., Praha, ČR). Stříkačka obsahující kostní dřeň byla transponována v rámci platných pravidel tkáňového zařízení.

Expanze MSC z kostní dřeně byla provedena podle pravidel Správné výrobní praxe (SVP, angl. Good Manufacturing Practice) a zajištění kvality dle protokolů Bioinova, s. r. o. Po transportu do zařízení SVP byla izolována mono-nukleární frakce kostní dřeně. Mononukleární frakce byla nasazena do plastových kultivačních lahví (40 000-70 000 buněk/cm2, 75 cm2 TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Švýcarsko) a ponechána po dobu 24-48 hodin ke spontánní adhezi. Neadherentní buňky byly odstraněny náhradou média. Adherentní buňky byly kultivovány při teplotě 37 °C ve z vlhčené atmosféře obsahující 5 % C02 v médiu MEM Alpha (Lonza, Walkersville, Maryland, USA) obohaceném o lyzát krevních destiček (Bioinova, s. r. o., Praha, CR) a  gentamycin (Gentamicine Lek?; Lek Pharmaceuticals, Ljubljana, Slovinsko). Médium bylo měněno dvakrát týdně. MSC byly identifikovány na základě vřetenovitého tvaru buněk a jejich adheze k plastiku kultivačních lahví. Po dosažení konfluence byly buňky extrahovány pomocí TrypLE? (Life Technologies, Carlsbad, California, USA), poté přeneseny a znovu nasazeny na čistý plastový povrch kultivačních lahví. Výsledná suspenze buněk byla získána ve třetí pasáži. MSC byly charakterizovány z hlediska počtu, viability a  určení povrchových markerů. Dále byla provedena zkouška sterility a následně byly MSC propuštěny aplikaci. Konečný léčebný přípravek použitý k léčbě ruptury rotátorové manžety obsahoval 10 ? 4,5 x 106 MSC.

Chirurgie rotátorové manžety
ACHOT 3/2015

Všichni pacienti zařazení do studie byli operováni stejným operatérem na pracovišti prvního autora. Operace byla provedena v poloze na boku v celkové anestezii. Zákrok vždy začal diagnostickou gleno-humerální artroskopií za použití standardního zadního vstupu s artroskopickou pumpou zajišťující tlak 50 mm Hg. Technikou outside-in byly zhotoveny standardní horní přední, posléze i laterální přístupy. Ruptura rotátorové manžety byla vždy nejprve intraartikulárně označena PDS vláknem vsunutým perkutánně přes jehlu. Optika byla poté přesunuta do subakromiálního prostoru, kde byla lokalizována leze manžety. Tvar leze byl klasifikován dle tvaru (L typ, U typ, srpkovitý typ). Rozměry leze v předozadním průměru byly měřeny artroskopickou milimetrovou měrkou a zaznamenány (klasifikace dle DeOrio a Cofielda: menší než 1 cm = malá, 1-3 cm = střední, 3-5 cm = velká, 5 cm a více = masivní). Po okrvavení okrajů leze i úponu šlachy v oblasti tubercu-lum major bylo následně přistoupeno k  provedení sutury rotátorové manžety za použití kotvícího materiálu Fastin (Mitek, USA). Následně byla po testu mobility a pevnosti sutury provedena standardní akromioplastika. Během finální fáze operace byla pod artroskopickou kontrolou po vypnutí tlakové pumpy a vypuštění proplachové laváže do lože sutury mezi obě části šlachy injikovaná suspenze s MSC o obsahu 1,5 ml (obr. 2, 3, 4, 5).

VÝSLEDKY

ACHOT 3/2015

Konečné hodnocení v 6 měsících od operace bylo provedeno u 8 pacientů z 10. Dva pacienti (druhý a třetí v pořadí) byli ze studie vyřazeni na základě naplnění vylučovacích kritérií - jeden z důvodu výskytu akutní angíny v době časování definitivního operačního zákroku po pomnožení MSC, druhý z důvodu nesplnění indikačních kritérii v peroperačním nálezu (nález pouze parciální netransmurální ruptury šlachy supraspinatu a současná masivní SLAP leze). Souhrn výsledků získaných během sledování pacientů v daných intervalech je shrnut v tabulce 3. U všech pacientů došlo k signifikantnímu zlepšení klinického nálezu již v 6. týdnu od operace, všechna sledovaná klinická skóre byla zlepšena v 6 týdnech, ve 3 i 6 měsících, ve srovnání se stavem před operací. Průměrné hodnoty při kontrole 6 týdnů od operace byly následující: VAS = 14 , Constant skóre = 50, UCLA skóre = 20. Průměrné hodnoty 6 měsíců od operace byly VAS = 0, Constant skóre = 84, UCLA skóre = 32. MRI nález v 6 měsících ukázal plně zhojenou a prostavěnou tkáň úponu rotátorové manžety u  všech 8 hodnocených pacientů (obr. 6). V průběhu období sledování nebyly zaznamenány žádné nežádoucí účinky léčby, žádný z pacientů nebyl vyřazen z  důvodu výskytu komplikací léčby.

DISKUSE

Využití autologních kmenových buněk a růstových faktorů pro terapii šlach, svalů a chrupavek je v současné době předmětem řady výzkumných studií na experimentálních zvířecích modelech, s ne zcela konzistentními výsledky (9, 24, 26), přičemž klinické využití je zmiňováno zatím pouze okrajově.

Během posledních 15 let bylo provedeno mnoho studií na zvířecím modelu za použití širokého spektra adjuvantních biologických faktorů, včetně MSC. V  rámci hodnocení histologického obrazu, pevnosti abiomechanických vlastností zhojené šlachy bylo zvažováno také použití nejrůznějších nosičů, jako jsou kolagenní gely, kolagenní síťky, fibrinové nosiče, apod., s cílem udržení buněčných preparátů v místě leze, ať již v oblasti Achillovy šlachy, patelárního ligamenta, či manžety rotátoru ramenního kloubu. Většina studií hodnotí oblast buněčné augmentace hojení šlachy jako významnou, ve smyslu techniky aplikace, množství a koncentrace MSC však stále neexistuje jasný konsensus (1, 8, 17, 20, 25). Yokoya a kol. prokázali na králičím modelu pozitivní efekt MSC na regeneraci šlachy rotátorové manžety jak při jejím úponu, tak při přechodu na svalové bříško (26). Naproti tomu Gulotta a kol. na modelu laboratorního potkana neprokazují změnu struktury či síly šlachy ve fázi hojení po přidání MSC (9).

Pracoviště autorského kolektivu se problematice klinického terapeutického využití MSC a růstových faktorů při hojení chrupavky, šlach a svalů v  posledních několika letech usilovně věnují (10, 23). Autoři ve vlastní preklinické studii prokázali, že lidské multipotentní MSC po aplikaci do oblasti šlachové leze u laboratorního potkana urychlují neovaskularizaci a  reorganizaci tkáně šlachy v procesu hojení, což bylo prokázáno vyšší produkcí kolagenu I a III a lepší histologickou strukturou novotvořené šlachy, ve srovnání s kontrolní skupinou bez terapie (24).

K dnešnímu dni neexistuje humánní klinická studie s využitím kultivovaných kmenových buněk získaných z kostní dřeně. Existuje pouze jedna lidská studie (Level IV) hodnotící klinické využití nekultivovaných mononukleárních buněk (MNC), ve které Ellera-Gomes a kol. (4) prokázali na 14 pacientech zlepšení klinického skóre a "dobrou reparační integritu" na MRI po operaci ruptury rotátorové manžety s adjuvantní aplikací nekultivovaných MNC. MSC byly v dané studii získány před zákrokem z crista iliaca, zpracovány pomocí Ficollova-Hypaqueova gradientu hustoty, a poté znovu resuspendovány ve fyziologického roztoku obohaceného 10% autologním sérem. Autoři neporovnávali výsledky s kontrolní skupinou, přičemž hlavním cílem jejich studie byla, obdobně jako v naší práci, bezpečnost metody se související limitací výstupů ve vztahu k efektivitě terapie (Level IV).

Žádná z publikovaných studií k dnešnímu dni neprokazuje karcinogenní potenciál či nežádoucí buněčné mutace MSC při jejich lokální aplikaci do oblasti pojivové tkáně. Přestože díky autolognímu původu MCS není předpoklad vzniku lokálních či systémových nežádoucích účinků, aplikace MSC není z pohledu vývojových toxikologických studií doporučována těhotným ženám a pacientům ve věku do 18 let (15).

Předložená práce je předběžným výstupem z probíhající klinické studie, jejíž souhrnné závěry budou po ukončení studie taktéž publikovány, přičemž primárním cílem klinické studie je posouzení bezpečnosti použití kultivovaných autologních MSC. První předběžné výsledky v našem souboru pacientů potvrzují bezpečnost a dobrý efekt použití autologních kultivovaných MSC, jakkoli validace výstupů ve smyslu efektu metody bude do budoucna záviset na zhodnocení většího počtu pacientů zařazených do studie, včetně jejich korelace s konvenční technikou ošetření ruptury rotátorové manžety bez použití adjuvantní buněčné terapie. V prezentovaném souboru 8 pacientů nebyly v  šestiměsíčním sledování zaznamenány žádné klinické ani laboratorní nežádoucí účinky spojené s terapeutickým využitím kultivovaných lidských MSC, jakožto ani žádné další komplikace léčby.

ZÁVĚR

Předběžné výsledky ukazují, že terapie s využitím kmenových buněk pro reparaci a regeneraci šlachy a svaluje slibným terapeutickým přístupem v chirurgii ramenního kloubu. Třebaže v rámci in vivo prováděných studií na laboratorních zvířatech byly prokázány slibné výsledky této metody ve smyslu posílení hojení šlachy rotátoru, užití MSC v chirurgii ramenního kloubu by mělo být stále považováno za experimentální techniku a je zapotřebí dalšího klinického výzkumu k průkazu efektu této adjuvantní metody hojení šlachy. Publikovaná práce prokazuje bezpečnost metody na omezeném počtu pacientů v šestiměsíčním sledování. Další výsledky probíhající klinické studie budou publikovány po jejím vyhodnocení.

Literatura

Celá stať v dokumentu PDF

Zpět


Nabídka nakladatelství:

 

Peter Wendsche, Radek Veselý et al.
Úskalí a komplikace při léčení zlomenin

Úskalí a komplikace při léčení zlomenin

 

Petr Chládek
Femoroacetabulární impingement syndrom

Femoroacetabulární impingement syndrom

 

Ctibor Povýšil
Patomorfologie chorob kostí a kloubů

Patomorfologie chorob kostí a kloubů